揭示大枣治疗贫血的分子机制

点评 | 冀鹏（美国西北大学）、石莉红（中国医学科学院血液学研究所）

目前，促红细胞生成素（EPO） 及其类似物是临床上治疗贫血的主要药物。然而，研究表明，EPO在治疗贫血的同时，也造成肿瘤的增殖和转移，从而加剧乳腺癌、卵巢癌等肿瘤进展，这极大地限制了肿瘤患者的贫血治疗选择。因此，迫切需要开发新型药物以治疗癌症相关贫血。 碳点（CDs） 凭借其光学特性和结构特点，已成为潜在的生物医学材料。CDs的结构特性可使其易于被修饰，从而赋予抗癌或抗炎功能。优良的光学性能和光敏性使CDs在低功率密度激光照射下产生更高的热量，可进行电子或能量转移反应，能够用于光热疗法和靶向杀伤肿瘤细胞。最新研究表明，CDs还具有直接的生物治疗效果，有望应用于帕金森病和各种癌症治疗。

近日，郑州大学 张世杰、 卢思宇教授和纽约血液中心 安秀丽教授合作，在 Advanced Materials期刊发表了题为： Carbon dots as a potential therapeutic agent for the treatment of cancer-related anemia 的研究。 该研究利用红枣为反应前驱体制备了 红枣衍生碳点（J-CDs） ，借助体内、外实验揭示了 J-CDs可以通过调节低氧诱导反应和增加STAT5的磷酸化水平，刺激红系祖细胞的自我更新，最终促进红细胞有效生成；此外，J-CDs不影响肿瘤细胞的增殖和转移。由于生物碳点具有众多优良特性，并且大枣在传统中医中被认为是经典补血药物，所以，作者选取大枣作为碳源合成J-CDs。评估J-CDs的各项参数，证明J-CDs成功制备 （图1） 。首先，作者使用体外红系诱导分化体系评估J-CDs对人红细胞生成的影响，发现J-CDs对红系增殖的促进作用仅限于红系祖细胞阶段，因此，推测J-CDs可能促进红系祖细胞（BFU-E和CFU-E）的自我更新能力。为了验证该猜想，作者利用分选的BFU-E和CFU-E细胞进行了克隆形成能力检测，结果表明J-CDs有效增强了BFU-E和CFU-E细胞的克隆形成能力。随着红系分化，CFU-E进一步分化进入终末红系发育阶段，依次产生原始红细胞（Pro）、早幼红细胞（Baso）、中幼红细胞（Ploy）、晚幼红细胞（Ortho）和网织红细胞（Retic）。因此，作者接下来研究了J-CDs对终末红系分化的影响，结果发现：J-CDs虽然显著促进人类红系祖细胞的增殖，但是不影响终末红系分化和成熟红细胞的正常生成。图1 此外，作者进一步在体内评估了J-CDs对小鼠红细胞生成的影响 （图2左） 。结果发现：J-CDs处理的小鼠其外周血中的红细胞、血红蛋白水平、红细胞压积以及网织红细胞比例均显著增加。对骨髓造血进行检测发现：J-CDs处理后，小鼠的Ter119+细胞（终末发育阶段的红细胞）显著增加。使用CD44与Ter119表面标志进行流式分析证实：J-CDs处理的小鼠骨髓中pro：baso：poly：ortho仍为1:2:4:8的正常比例。作为成年小鼠的另一个重要造血器官，脾脏是应激性红细胞生成的主要部位。J-CDs处理造成小鼠脾脏中的有核红细胞显著升高，应激造血明显。此外，J-CDs治疗对小鼠的脑、心、肺和肝的形态并没有影响。 那么J-CDs对体内红系造血的促进，是否同样由于J-CDs对红系祖细胞的促进作用？实验证实，骨髓中分选的BFU-E与CFU-E在经过J-CDs处理后，形成的克隆数量增加、克隆尺寸变大，与体外结果一致。有趣的是，J-CDs对造血干/祖细胞和其他谱系细胞均没有明显影响，只特异性促进小鼠红系祖细胞的增殖。 图2 目前，EPO已广泛应用于贫血的临床治疗，但近年来多篇报道表明EPO可促进卵巢癌、乳腺癌及多种癌症的进展，而这使得EPO被限制应用于相关病种。那么作为同样可以促进红细胞生成的J-CDs是否影响癌症的进展？为排除这一疑虑，作者使用卵巢癌（A2780和SKOV3细胞系）、乳腺癌（MDA-MB-231和MCF7细胞系）以及异种移植模型来验证J-CDs对肿瘤进展的影响（图2右）。结果证实J-CDs并不影响卵巢癌、乳腺癌等的肿瘤增殖，同时也不影响卵巢癌细胞荷瘤小鼠的存活率。研究证实，EphB4是EPO在卵巢癌和乳腺癌中的直接受体，通过促进STAT3的磷酸化造成肿瘤进展。因此，作者进一步检测了J-CDs对STAT3磷酸化水平的影响。结果显示J-CD不影响卵巢癌和乳腺癌细胞中STAT3的磷酸化水平。 为探索J-CDs促进红系祖细胞自我更新的分子机制，该研究检测并分析J-CDs组与对照组分选的CFU-E细胞的RNA-seq数据。结果发现，J-CDs处理后CFU-E细胞中上调最明显的通路是对低氧诱导的反应。这一通路协调了EPO的产生、铁的摄取和利用，以及骨髓微环境的调节，以最终促进红系祖细胞增殖。此外，通过评估JAK2/STAT5、PI3K/AKT和RAS/ERK级联信号通路，作者发现J-CDs治疗仅仅显著增加人类红系细胞与小鼠骨髓Ter119+细胞中STAT5的磷酸化水平，对ERK和AKT的磷酸化水平并没有明显影响。以上结果表明J-CDs促进红系细胞增殖，并不是通过诱导缺氧来增加EPO水平，而是通过一种不涉及EPO的特殊机制。 综上所述，该研究利用红枣合成了独特的J-CDs生物碳点，发现J-CDs对红细胞的产生有显著的促进作用，但对HSC稳态、造血祖细胞的定向分化或其他谱系细胞的发育没有影响，只特异性地促进红系祖细胞的自我更新能力。并利用体内、外实验证实了J-CDs对卵巢癌和乳腺癌等的进展没有明显的影响。

最后，机制研究证明，J-CDs通过调节低氧应答途径和上调STAT5的磷酸化水平来促进红系祖细胞的增殖。该研究为贫血治疗，特别是癌症相关贫血的治疗提供新的选择。郑州大学生命科学学院张世杰副教授、郑州大学化学学院卢思宇教授和纽约血液中心安秀丽教授为该论文的共同通讯作者，徐原林、王柏杨和张明明为共同第一作者，张晶鑫副教授、曲晓利副教授等为论文的重要作者。

专家点评冀鹏（美国西北大学）

贫血是世界范围内的重要公共卫生问题之一。尤其是在癌症患者中，无论接受治疗与否，贫血已经成为其常见的并发症。贫血症状的出现会造成患者对治疗耐受性的降低，最终影响整体生存率。在药物治疗方面，促红细胞生成素（EPO）及其类似物已被开发用于贫血的临床治疗。然而，近些年多篇临床报告和基础研究报告显示，EPO可以刺激肿瘤增殖和转移。这极大地限制了这种治疗方法的临床应用。因此，开发新的有效药物来帮助管理和治疗癌症相关贫血意义重大。 交叉学科的发展给人们提供了更多的思路和选择。其中碳点（CDs）作为一类新兴的、小尺寸的碳纳米材料，由于其良好的生物相容性和特殊的物理化学性质，已经被报道可以在体外和体内发挥直接的治疗作用。本研究中，研究人员以具有补血功能的红枣为前体利用一步水热法制备了红枣衍生碳点（J-CDs），体内外实验证明J-CDs可以通过调节低氧应答反应和增加STAT5的磷酸化水平特异性地刺激红系祖细胞的自我更新从而显著促进红细胞的生成（不影响造血干祖细胞的稳态以及红系终末分化及成熟）。最重要的是，J-CDs的应用可以有效改善小鼠肿瘤模型的贫血症状，而不会促进肿瘤细胞的增殖。 该研究是材料化学与生物医学的有效结合，是交叉学科的成功尝试。J-CDs的成功开发不仅可以为癌症相关贫血的治疗提供新的、有前途的选择，而且也进一步拓宽了以CDs为代表的纳米药物在生物医学方面的应用。

石莉红（中国医学科学院血液学研究所）

揭开枣生血之密贫血是一种世界性问题。世界卫生组织统计显示全球贫血人数已超过20亿，约占世界人口总和的30%，其中贫血所致生活无法自理患者约有8.8%。除了原发性贫血外，贫血也是多种重大疾病的常见并发症，包括慢性肾病、慢性感染、肝脏病、恶性肿瘤等。在恶性肿瘤中，贫血的发生率为40-60%，其导致的不良事件在肿瘤并发症中占到第三位。贫血造成患者生活质量降低，在肿瘤相关性贫血还导致患者对治疗耐受性降低，影响患者的生存。而当贫血改善后，不但显著提高了患者生存质量，而且还提升了抗肿瘤治疗的效果。当前贫血的治疗主要包括输血及促红细胞生成素（EPO）类药物。但是输血存在血源不足、铁过载、病毒感染等问题及潜在风险。EPO治疗也存在诸多问题，例如多种原发性及继发性贫血对EPO治疗不反应、在肿瘤中 EPO有可能促使导致癌细胞增殖等。因此，迫切需要开发新的靶向治疗贫血的药物。 碳点（CDs）作为一类有潜力的纳米医用材料，已经被广泛研究。目前研究人员发现CDs独特的表面聚合壳层与选择的前体有很大关联。在本研究中，研究人员以补血食材红枣为反应前驱体制备了红枣衍生碳点（J-CDs），与传统CDs相比，J-CDs来源于生物质，红枣中的丰富营养物质也被限阈在J-CDs的骨架中发挥重要价值。在体外诱导分化的人红细胞及小鼠体内，均发现J-CDs能显著促进红细胞生成。更为有趣的是，在肿瘤贫血模型中，J-CDs显著改善了贫血，但对肿瘤细胞增殖无影响。分子机制上，研究发现J-CDs促进红细胞生成的机制与EPO不尽相同，J-CDs特异通过影响STAT5磷酸化促进红系祖细胞增殖。J-CDs即不影响红细胞中EPO下游ERK、AKT等信号通路，也不影响肿瘤细胞中EPO介导的STAT3的磷酸化。体内外研究一致证明J-CDs能特异靶向治疗贫血。 该研究为贫血治疗提供了新的选择。鉴于贫血的患者基数庞大，治疗手段有限，尤其是考虑到EPO治疗肿瘤相关贫血存在的潜在风险，J-CDs的发现将造福广大的贫血患者；同时，使用具有药用价值的红枣作为碳源，增加了CDs原料的多样性，为中药衍生CDs和中药现代化提供实验基础，具有极其重要的社会、经济、医疗价值。此外，本研究中提示J-CDs特异性地促进红系祖细胞的增殖，对造血干祖细胞和其他系细胞影响不大，也侧面暗示出相对于其他谱系祖细胞，红系祖细胞可能在自我更新机制或接受药物方面具有一定的独特性，值得进一步深入研究。