《细胞》子刊：破解肿瘤对放疗耐受之谜

放化疗作为肿瘤患者标准治疗方案，一直沿用至今。可是，患者产生的耐药极大地限制了治疗的有效性。越来越多的研究发现，耐药的发生不仅仅和肿瘤细胞本身的耐药机制有关，而且跟肿瘤微环境的变化也有着千丝万缕的联系。

有研究发现，中性粒细胞浸润为肿瘤细胞的种植提供了转移微环境，增加胰腺癌肝转移风险[1]；肿瘤细胞表达的促癌蛋白TRIB3能够抑制CD8+T细胞浸润等等[2]。肿瘤微环境中的另一个“佼佼者”是成纤维细胞，它的功能多种多样，包括促进肿瘤发展[3]，介导CAR-T治疗的耐受[4]等。

不过，目前还不知道成纤维细胞是否参与了肿瘤对放化疗的耐受。

近日，德国癌症研究中心的Florian R. Greten教授团队在Cancer Cell杂志发表了一个重磅的研究[5]，阐述了炎症性肿瘤相关成纤维细胞（iCAF）与放化疗耐受、癌症复发和患者生存期缩短有关。

具体来说，放疗后肿瘤细胞释放的大量IL-1a不仅可以将肿瘤相关成纤维细胞（CAF）极化成为iCAF，还可以引起氧化DNA损伤介导的细胞衰老。这些作用最终导致了患者对于放化疗的耐受抵抗，造成疾病的进展。

也正是根据这一发现，他们提出放化疗联合IL-1受体阻断剂的治疗方案。

论文首页截图

接下来我们就一起来看看这个研究是如何开展的。

首先，Greten团队发现正常的直肠癌统一分子亚型分类（CMS）方法并不能够成功预测无病生存时间（DFS）。

为了探索可能具有预测潜力的分子或者信号通路，他们用质谱对61个患者样本中肿瘤细胞的蛋白质组进行了检测。可是，对结果进行主成分分析（PCA）并不能够区分预后好和预后差的患者，这也表明决定直肠癌患者预后的可能不是肿瘤细胞本身。

为了找到决定直肠癌患者预后的关键因素，Greten团队开展了多色荧光免疫组化实验。结果发现，当比较预后好和预后差患者样本的各类细胞群时，只有间充质细胞在两组之间存在差异。进一步的基因富集分析（GSEA）也发现，预后差患者的肿瘤样本中存在iCAF相关基因高度富集。

多色荧光试验显示预后有差异的两组患者肿瘤组织中间充质细胞比例存在不同

为了进一步验证iCAF在其中的功能以及潜在的机制，Greten团队建立了原位类器官肿瘤小鼠模型。

在原有的APTK（Apc、Trp53、Tgfbr2、K-rasG12D等基因的突变）肿瘤类器官模型上，他们增加了肉豆蔻酰化AKT，得到了APTKA肿瘤类器官模型。前期研究已经证明APTKA肿瘤模型具有间质相关基因的富集，更强的侵袭性以及更容易自发肝转移的特点[6]。

Greten团队发现，接受放射治疗后的APTKA肿瘤出现了更多的肝转移，且伴随着DCN+成纤维细胞、F4/80+巨噬细胞以及Ly6G+中性粒细胞增多，以及CD8+T细胞减少。

在APTKA原位类器官小鼠模型中，放疗引起更大程度的肝转移，且伴随DCN+成纤维细胞增多

奇怪的是，如果在体外分别对APTK和APTKA肿瘤类器官进行放射处理后再移植于小鼠皮下，则两种类型的肿瘤生长都受到了抑制，提示APTKA类器官对放射治疗的耐受很大程度是由基质细胞介导的。

为了进一步验证APTK和APTKA类器官模型是否可以通过旁分泌来影响成纤维细胞，Greten团队用培养APTK和APTKA的上清液分别处理小肠原代成纤维细胞，24h后对成纤维细胞进行RNA测序，并结合APTKA小鼠肿瘤中CAFs的单细胞测序结果，发现APTKA肿瘤中IL-1依赖的细胞簇最为重要。

之后，Greten团队对通路分析进一步发现，相较于APTK来源的上清液，APTKA上清液处理能够明显激活NF-κB和p38信号通路，并且，用IKKβ和p38的抑制剂均可以抑制促炎相关基因的表达。

IKKβ和p38的抑制剂均可以抑制APTKA上清激活的促炎因子的表达

那这种变化与APTKA上清液中的哪种细胞因子有关呢？

为了找到这个关键细胞因子，Greten团队又分别对APTK和APTKA类器官进行RNA 测序，分析显示一些细胞因子在两种类器官之间的表达存在较大的差异。

之后他们利用这些细胞因子对应的中和性抗体去中和这些细胞因子，并检测了APTKA上清液处理成纤维细胞后的促炎相关基因的表达情况。结果发现，只有在中和了IL-1a的情况下，ATPKA上清液激活成纤维细胞表达的促炎相关基因才会受到抑制。进一步说明了iCAF的分化是通过IL-1a来介导的。

至此，Greten团队发现了IL-1a是肿瘤细胞与成纤维细胞传递信息的重要信号。那是不是意味着阻断这个通路能够降低对治疗的耐受呢？

为了验证这一想法，他们用IL-1受体的阻断剂anakinra处理小鼠，十天后再进行放射治疗，发现anakinra能够明显降低肿瘤负荷和侵袭能力。

小鼠体内实验也证明anakinra能够抑制肿瘤的侵袭性

之后，Greten团队进一步分析了CAFs是如何介导放射治疗的耐药发生的。他们发现，在放射处理后，APTKA上清诱导极化的成纤维细胞产生了p53依赖的衰老现象，并伴随着细胞周期蛋白表达的变化。

那么上述在小鼠模型中观察到现象，是否能够用来预测直肠癌患者对治疗的反应情况呢？

Greten团队收集患者治疗前的血清样本，发现IL-1a浓度低于可检测范围，且IL-1β以及大部分的细胞因子均不能够预测患者的预后情况。但有意思的是，血清中IL-1ra的浓度在预后差的患者中显著下降。因为IL-1ra是IL-1信号通路的拮抗分子，所以，该现象也表明预后差的患者中存在IL-1信号的激活。

预后差患者的血清IL-1ra浓度低于预后好的患者

这个研究表明了IL-1ra与导致患者预后差的成纤维细胞有着直接的联系，并进一步为CAFs在治疗敏感性中的重要意义提供了证据，也为未来在肿瘤患者的化疗方案上提供了重要的理论基础。

iCAF引起直肠癌患者放化疗耐受的示意图

参考文献：

1.Bellomo, G. et al. Chemotherapy-induced infiltration of neutrophils promotes pancreatic cancer metastasis via Gas6/AXL signalling axis. Gut gutjnl-2021-325272 (2022) doi:10.1136/GUTJNL-2021-325272.

2.Shang, S. et al. TRIB3 reduces CD8+ T cell infiltration and induces immune evasion by repressing the STAT1-CXCL10 axis in colorectal cancer. Science translational medicine 14, eabf0992 (2022).

3.Murray, E. R. et al. Disruption of pancreatic stellate cell myofibroblast phenotype promotes pancreatic tumor invasion. Cell reports 38, 110227 (2022).

4.Sakemura, R. et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood (2022) doi:10.1182/BLOOD.2021012811.

5.Nicolas, A. M. et al. Inflammatory fibroblasts mediate resistance to neoadjuvant therapy in rectal cancer. Cancer Cell 40, 168-184.e13 (2022).

6.Varga, J., Nicolas, A., Petrocelli, V., … M. P.-J. of E. & 2020, undefined. AKT-dependent NOTCH3 activation drives tumor progression in a model of mesenchymal colorectal cancer. rupress.org.

责任编辑丨BioTalker